1 葡萄籽原花青素的概念、性質和安全性
1．1 原花青素的概念
研究表明，葡萄籽中原花色素物質只有原花青素 壹種[21。關於原花青素的定義還不統壹。原花青素因在 酸性介質中加熱產生紅色的花青素而得名3，而兒茶素 類單體在熱酸條件下反應沒有花色素現象，所以兒茶 素單體應不屬於原花青素。這個概念也得到了美國葡 萄籽方法評定委員會和國內主要生產葡萄籽提取物的企業認可。葡萄籽原花青素是由兒茶素、表兒茶素及其 沒食子酸酯通過C4-C 或C4-C。鍵***價相連組成的多 聚體 ，結構通式見圖l5J。通常把二～四聚體稱為低聚 體(OPCs)，五聚體及五聚體以上的稱為高聚體。
R=3p—OH兒茶素，R=3p—O壹沒食子酸兒茶素O壹沒食子酸酯 R-3a-OH表兒茶素。R-3a-O壹沒食子酸表兒茶素o-沒食子酸酯
圖1 原花青素的結構及其組成單元
1．2 原花青素的主要性質
原花青素在熱酸條件下能夠生成紅色的花青素，此性質可用於原花青素的定性和定量分析。結構中具 有較多的羥基，具有較大的極性，使其能夠很好的溶解 於水、甲醇、丙酮、乙醇等極性溶劑而不溶解於苯、氯 仿、石油醚等非極性物質。較多羥基結構也使其成為良 好的氫原子給予體，具有較強的抗氧化性質。研究表 明，在0 壹、·OH、·CH，中，原花青素對0：壹·清除能力最 好，而且在聚合度2～5之間範圍內，隨聚合度增加而增 加柳。對其構效關系分析表明，帶有沒食子酰基的原花青 素具有更強的抗氧化活性，二聚體的抗氧化活性均比單 體兒茶素的活性強。c 壹c 連接的二聚體比c 壹c 連 接的二聚體具有更強的抗氧化活性 。原花青素的最大 吸收波長在280 nm附近，使其具有較強的紫外吸收能 力。以上的主要性質使原花青素很好的用於保健食品 和化妝品的開發。
13 原花青素產品的安全性
美國Creighton大學葡萄籽原花青素研究組與美 國環境保護局根據有毒物質控制條例健康效果測試手 冊協同進行了葡萄籽原花青素萃取物(GSPE)的壹系 列毒性和生物功效研究。結果證明GSPE具有很高的 安全性和很好的清除自由基、抗氧化能力8。日本學者 Yamakoshi等也采用壹系列毒理性試驗確證富含原花 青素的葡萄籽提取物具有很高的安全性。完全可以用 於功能性食品的開發.
2 原花青素的提取方法
提取原花青素常用的方法有水提取法、有機溶劑壹 水提取法和儀器輔助提取法。葡萄籽中的原花青素物 質通常以結合態與蛋白質、纖維素結合在壹起fl01，壹般 不易提出，通常選用有機溶劑或水提取，具有斷裂氫鍵 的作用。同時由於有機溶劑的滲透性較差，壹般不單獨 使用，常需要水作為傳質劑。
2．1 水提取法
Masquelier~l-嘬早從松樹皮中用沸水粗提、乙酸乙 酯純化得到原花青素。選水作為提取劑，浸提耗時長， 溫度高，容易造成原花青素的損失。同時水的極性較 大，溶出雜質也較多。
2．2 有機溶劑壹水提取法
甲醇、丙酮、乙醇和乙酸乙酯是提取葡萄籽原花青 素常用的有機溶劑，它們對原花青素有很好的溶解性， 它們的極性大II,Jt~序為甲醇>乙醇>丙酮>乙酸乙酯。 乙醇是常用的提取溶劑，價格低廉，來源豐富。乙酸乙 酯提取出的原花青素成分生物活性較好，但是由於極 性較小，對原花青素的提取並不完全。甲醇和丙酮水溶 液(50％～75％)對原花青素都有較好的提取性能，同時也多用做原花青素含量測定時的提取溶劑。熊何 -21比 較了甲醇、乙醇、丙酮水溶液對多酚的提取效果，結果 表明70％丙酮水溶液為最好溶劑。丙酮水溶液提取效 果好的原因：原花青素分子含有多個苯環和醚鍵，油溶 性較強，同時又有大量的羥基連接在分子骨架上，在水 中具有很好的溶解性，擁有油水雙溶性的丙酮與之相 互匹配，原花青素的溶解度自然增加，其提取率相應得 到提高。
2-3 儀器輔助提取法
超臨界萃取和超聲波輔助提取越來越多的用於葡 萄籽原花青素的提取。超臨界CO：萃取率高，而且使原 花青素不受到空氣和光的影響，但由於設備昂貴，推廣 使用比較困難。超聲波法應用比較廣泛，超聲波產生的 強烈振動、高的加速度、強烈的空化效應、攪拌等特殊 作用，可以破壞植物的細胞壁，使溶劑滲透到細胞中， 令其中的化學成分溶於溶劑中，從而提高提取效率。 在提取原花青素之類的熱敏性物質顯示出優越的性 能.
3 葡萄籽原花青素的檢測
由於葡萄籽和葡萄籽提取物中大多數多酚是原花 青素(壹般占70％～85％)，所以很多廠家使用原花青 素來標定其中有效成分的含量。原花青素含量是反映 葡萄籽提取物或葡萄籽質量的關鍵指標，主要有兩個 指標，分別為原花青素值和原花青素含量。
3．1 原花青素值的測定
原花青素值的測定采用Bates—smith法和Poaer 法。原理：原花青素在酸性條件下加熱轉化為紅色的花 青素，而兒茶素、表兒茶素等黃烷壹3壹醇單體沒有此反 應(圖2)。它們測出的結果是原花青素的相對含量，分 別用原花青素指數和PVU表示，是根據經驗公式求得 的。葡萄籽提取物中的原花青素指數壹般在80～100之 間，PVU壹般在250～350之間。
原花青素值只是相對含量，並非原花青素的真實 含量。據調查，同為原花青素值95的產品，多酚含量相 差15％，質量大相徑庭四。很多生產廠家使用原花青素 指數來表示葡萄籽提取物中原花青素的百分含量是錯誤的。
圖2 花青素生成反應 Fig．2 Reaction ofproducing cyaniding
3．2 原花青素含量的測定
原花青素的含量測定方法很多，也比較混亂。常用 的有以下幾種方法。
3．2．1 鐵鹽催化法
此方法的反應原理與原花青素值測定原理相 同，在計算原花青素的含量時使用了原花青素標準 品。Fe¨、鹽酸為常用的催化劑和酸解劑。由於水、乙 醇為反應介質時吸光值很低，壹般采用正丁醇為反 應介質15-161。通常的具體操作：取1．0 mL樣液(或原花 青素溶液)於10 mL刻度試管中，加入6．0 mL正丁醇壹 濃鹽酸(95：5)與2％ 硫酸鐵銨溶液(溶解於2 mol／L 鹽酸)0．2mL，混勻，置於沸水浴中加熱40min後，立即 取出用冰水快速冷卻至室溫，在550 Nm處測定吸光值。
此方法較簡便，而且對原花青素的選擇性反應較 好。鐵鹽催化法對反應體系中的含水量和Fe 濃度要求 比較嚴格，壹般要求含水量6％，Fe 濃度4．5x10 ％， 而且過高的Fe¨濃度對反應沒有影響l51。傅武勝l61 研究表明3％～4％為合適的含水量，Fe 濃度選擇在 9．OxlO ％左右。但是也有學者總結分析2％～6％含 水量對花青素的形成有抑制作用，稍高的Fe¨濃度 (>15 g／L)也抑制花青素的生成.
在鐵鹽催化反應的基礎上，楊大進l I等人利用高 效液相色譜法檢測了原花青素含量。該方法將原花青 素在上述鐵鹽催化條件下生成的深紅色花青素離子 進行高效液相色譜分析，從而確定原花青素的含量。 此方法能夠排除部分雜質的影響，具有定性定量準確 的優點。
3．2．2 香草醛法
測定原理：原花青素和兒茶素類單體的A環的化 學活性較高，在酸性條件下，其上的問苯二酚或間苯 三酚與香草醛發生縮和，產物在濃酸作用下形成紅色 的正碳離子，樣品的濃度與產生的顏色呈正相關，在500 llm波長下測定其吸收光值l91(圖3)
圖3 酚醛縮合反應
香草醛法測定時，壹般以兒茶素為標準物，以甲醇為溶劑。鹽酸、硫酸均可作為反應過程的催化劑，但在 使用硫酸時，濃度不易過高，過高的硫酸易使香草 醛發生自縮合反應和氧化分解 。具體的操作方式 較多：1 mL試液+2．5 mL 1％香草醛甲醇溶液+2．5 mL 25％硫酸或8％鹽酸(均溶解於甲醇)，30。二下反應 15 min～20 min2l。醜 ；1 mL試液+6 mL 4％香草醛甲醇 溶液+3 mL濃鹽酸，室溫下反應15 minL231；有的更是在 2O℃下反應15 h[241。操作方式差別較大，不利於使用 者的選擇，有待於統壹。
3．2_3 紫外分光光度法
原花青素為無色物質，在可見光區無特征吸收峰， 在紫外區有唯壹特征吸收峰，最大吸收波長在280 Nm 處。盡管此方法簡單快捷，但是此方法只適用於原花青 素含量純度特別高的產品，不適合壹般原料中原花青 素的檢測。這是因為兒茶素類在280 Nm處也有最大吸 收，V 、Vc、Ve。、Ve 、蘆丁、B壹胡蘿蔔素等物質在此波長 處都有明顯的吸收.
3．2．4 Folin—Ciocaheau與HPLC結合法
此方法為美國葡萄籽方法評定委員會推薦使用的 方法。Folin—Ciocaheau法測定的是多酚含量，壹般以沒 食子酸為對照物。在堿性溶液中，多酚可以將鎢鉬酸還 原，生成藍色的化合物，在760 Nm處有最大吸收。葡萄 籽提取物中的多酚含量壹般在75％～95％之間。利用 HPLC測定沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒 食子酸酯四種單體的含量來代表單體的總量。這是因 為它們四種單體的含量占到了葡萄籽提取物中單體含 量的90．0％以上。原花青素的含量則為多酚含量與單 體含量相減之差。
此方法缺點是蛋白質、氨基酸、核酸、抗壞血酸等 易被氧化的物質也參與Folin—Ciocalteau反應。同時由 於葡萄籽提取物中沒食子酸含量甚微(0％～1．2％)，與 兒茶素(1．5％～7．3％)和表兒茶素(2．0％～5．1％)含量 相差懸殊四，原花青素含量用沒食子酸量來表示缺乏 代表性。
3．2．5 鉬酸銨分光光度法
它是基於鄰苯二酚與鉬酸銨在弱酸性介質中生成 黃色鉬酸酯，反應產物在333 nm波長處具有最大吸收。 馬亞軍 寸檢測條件進行了簡單摸索：取0．08 mol，L鉬 酸銨1 mL溶液置於25mL比色管，加人適量試液，用 1．OxlO mol／L鹽酸沖至刻度，反應瞬間完成。
根據反應原理，花色素、沒食子酸、兒茶素類都具 有鄰苯二酚結構，也參與鉬酸酯的生成，測定原花青素 的選擇性不高，受到雜質影響較大。
3．2．6 其它測定方法
馬亞軍 對原花青素含量測定方法進行了研究： 高鐵鹽壹鐵氰化鉀分光光度法，它是基於原花青素能將 Fe 還原成Fe ，Fe 與鐵氰化鉀生成可溶性深藍色配 位化合物，在710 nm處有最大吸收的原理；硫酸高鈰 銨分光光度法，它是基於原花青素與Ce“在強酸性介 質中反應生成無色的Ce ，Ce“在319 nm波長處具有 最大吸收，通過測定黃色高鈰鹽的吸光度，間接測定原 花青素。另外還有流動註射壹抑制化學發光法[271：在堿 性條件下，利用原花青素還原H：O：可抑制魯米諾壹 H20 體系的化學發光，其抑制的程度與原花青素濃度 之間呈線性關系。這三種方法如同Folin—Ciocaheau法 利用多酚的還原性質測定多酚含量的原理，結果都擴 大了原花青素的含量。
綜上所述，原花青素值的測定只是根據經驗公式， 並不是原花青素真實含量，與現代檢測方法相落伍。鐵 鹽催化法測定原花青素專屬性較強，有很好的應用前 景，但仍需要進壹步的研究與改進。香草醛法測定的是 原花青素和黃烷壹3壹醇單體的總量，與HPLC法檢測黃 烷壹3壹醇單體：兒茶素、表兒茶素含量相結合起來可以 計算原花青素的含量。但是香草醛法操作方式較多，不 利於使用者選擇，具體操作方法還需要進行統壹。國外 有學者利用HPLC／MS技術分析和檢測原花青素，過程 比較復雜，技術要求高，不能廣泛應用於原花青素產品 的測定。
4 展望
葡萄籽原花青素擁有高效的抗衰老、抗心血管疾 病、抗癌功能，此外還具有抗輻射、抗疲勞，改善記憶力 等作用，顯示出了無比的優越生物活性和安全性。目前 我國生產和銷售葡萄籽提取物就有50多家，年生產能 力超過80 t。因此，為了與葡萄籽提取物行業的蓬勃發 展相適應，迫切需要建立起統壹的葡萄籽及其產品中 原花青素含量的測定方法，以利於企業的生產貿易、產 品的質量控制和顧客的消費指導。