QPCR引物設計+在線驗證
方法1: NCBI探針
1.在NCBI之前，有壹個直接設計引物的探針選項，這將給出上遊和下遊序列。例如，搜索小鼠nanog基因，得到如下兩個引物:
上遊引物:TTGCTTACAAGGGTCTGCTACT
下遊引物:ACTGGTAGAAGAATCAGGGCT
方法二:Primer3web
參考:Primer3web在線底漆設計——2分鐘學會極簡主義的底漆設計！-畢麗·畢麗
2.1.尋找基因序列
以人p53為例，設計引物。
PubMed官網:
第壹步:下拉選項選擇核苷酸。
第二步:輸入基因+物種+mRNA(例如p53humanmRNA)。
第三步:點擊搜索。
第四步:單擊並選擇左欄中的(mRNA4.782)。
第五步:點擊進入我們要找的p53humanmRNA的第壹篇文章(Homosapiens _ mRNA _ for _ p53，完整CDs)。
步驟6:單擊選擇功能中的CDS選項。
第七步:點擊選擇FASTA格式，就會出現這個基因的CDS系列。
2.2.開始設計引物。
Primer3web官網:
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進入Primer3web官網後，進行如下操作:
第壹步:從下拉項中選擇物種(人類)。
第二步:在輸入框中輸入剛才復制的CDS序列。
第三步:點擊選擇引物。
步驟4，輸出引物序列；最終結果，有四對引物可供選擇。
選擇合適的底漆:如何合適？
首先要看引物的擴增長度，最好擴增在100~300bp之間；
引物的長度為20~25bp，上下遊引物的差異不應超過5bp。
然後看Tm值，60℃左右，差值應該不會超過1℃。
再補充壹點:
既然設計了qPCR引物，就必須跨外顯子設計，以避免基因組DNA對CT值的影響。如果不跨越外顯子，放大溶解曲線的CT值會更小。那麽怎麽知道自己設計的引物是不是跨外顯子設計的呢？
答案是，我們可以將我們設計的引物的基因組位置與NCBI上該基因的外顯子和內含子的連接位置進行比較。直接看那個基因的mRNA的連接位置就可以了。
方法3:NCBI-爆炸-引物-爆炸
以上引物設計完成後，人工查找引物是否越過內含子太麻煩。然後普及更方便的方法。
參考:
3.1:在NCBI上找到目標基因的mRNA序列。
打開NCBI主頁面，選擇基因，輸入基因名稱--"顯示許多不同的同名基因--"找到妳想要的物種，打開--"顯示基因信息，找到" mRNAandprotein "前面的nm * * * * * * *，復制編號。
註意:這個時候妳會看到NM**** *的很多條信息，說明這個基因的不同同工型，可以通過查閱文獻和這些基因序列背後的解釋來確定。如果不清楚，壹般選最長的。
3.2.開始設計跨越外顯子的引物。
打開NCBI上的-BLAST-primer-blast網站，將上面復制的mRNA編號輸入到序列框中，從下拉選項中選擇妳的物種，然後從Exonjunctionspan下拉框中選擇primerusspananexon-exon junction，設置最小和最大引物長度，然後點擊Getprimer。您可以跳轉到Primer-blast結果頁面。這個過程會有點長，稍微等壹下。出來的時候有壹欄叫Graphicalviewofprimerpairs，會告訴設計的引物穿過了哪些外顯子。
從這些跨越外顯子的引物對中選擇最佳的壹對:
a)壹對引物中只有壹個引物穿過外顯子。(因為壹個引物穿過內含子，所以這個引物不會與基因組DNA匹配。即使另壹個引物與基因組DNA匹配，壹個引物也不會擴增任何東西。因為壹個引物的擴增達不到指數增長，幾十個循環後，信號就被正確匹配的指數增長的信號掩蓋了。就像普通PCR中，只有上遊或下遊引物，PCR中絕對沒有。因為產量太低。)
b)壹對引物之間的距離不能太長，因為擴增產物要在100-300bp之間，會影響ct值。
驗證自己設計的引物PCR產生什麽？可以做個電子PCR看看。
1.UCSC-芯片PCR工具
進入UCSC，選擇工具In-SilicoPCR，輸入上遊和下遊引物，選擇目標處的genomeassembly，點擊提交，或者如果妳不能通過這種方式出來，記得檢查FlipReversePrimer。因為上遊和下遊可能是顛倒的。如果提交成功，會出來壹個很長的序列，會告訴妳這個電子PCR完成後產生的序列的位置和起止長度。然後用NCBI的基因選項輸入自己PCR的目的基因，看目的基因的起始位置，就知道PCR是不是目的基因序列了。
註意:OCR產生的序列只能是目標基因的壹部分，只需比較序列的起始位置即可。因為引物是用目的基因設計的，所以通過PCR獲得兩個引物之間的序列。
進入NCBI-BLAST-primerBLAST；或者直接上這個網站:Primerdesigningtool()
在primerparameter中輸入您剛剛設計的上遊和下遊引物。
在數據庫下拉選項中選擇RefseqmRNA。
再次單擊Getprimer
等壹下，它會卡壹會兒妳才出來。
壹份詳細的初步報告出來了；上面說Productsontargettemplate都是HomosapientumorproteinP 53 (TP53)的不同轉錄本，產物的長度是壹樣的。表明該基因被這些引物擴增。
兩種驗證方法的優缺點:
UCSC驗證法可以測試妳擴增的所有序列；
NCBI的BLAST只能給出擴增產物是否是妳想要的基因以及擴增產物的長度。
選擇:建議用NCBI-blast-引物-BLAST法設計引物，也可以用NCBI-BLAST-引物-BLAST法驗證妳設計的引物。
技術分享qPCR引物設計有妙招-Zhihu()
比如基因Syt4(小鼠)設計的qPCR引物。
步驟1:輸入NCBI基因，找到該基因mRNA的NM * * * *號。
第二步:將該號碼輸入到NCBI-爆炸-起爆器-爆炸輸入序列框中，並檢查相應的條件；PCR產物的長度限制在70-300；由此，設計了10個跨內含子的引物，並根據Tm條件選擇第二對引物:
上遊:GTGTCTGGACTTTCAGATCCCT
下遊:CCAACCGTCCAATCACCTCA
第三步:將這對引物重新輸入NCBI-BLAST-primer-blast的上下遊引物框，點擊Getprimers。發現這對引物擴增出的唯壹基因是Syt4基因，說明這對引物具有良好的特異性。
第四步:進入UCSC-Tools-In-Silico PCR，輸入上遊和下遊引物，點擊提交。如果跳出後沒有產品，就回去調整參數，比如target parameter，FlipReversePrimer:是否檢查等。最終產物為Syt4，長度為220bp。說明這對引物的PCR產物具有很高的特異性，而且只有壹個產物。
第五步:進壹步驗證:因為引物是設計穿過內含子的，又提醒我上遊引物穿過了內含子，所以我輸入NCBI-核苷酸，輸入:Syt4MusmusculusmRNA，點擊搜索，然後點擊左欄的mRNA，再點擊第壹項......參考上面的步驟2.1。尋找這個基因的CDS序列，找到CDS序列後，我們搜索了上下遊兩個引物，發現都在CDS區域，這些引物的PCR產物序列也都在CDS區域。經過仔細檢查，我們發現上遊引物位於1203-1224，確實跨越了兩個外顯子:外顯子1098..126544.
以上，我們設計了Syt4基因的qPCR引物序列。可以由公司直接合成。
以上都是qPCR的引物設計。壹般情況下，擴增的基因產物僅在100-300bp之間，用於定量或半定量。但是如果妳想擴增全長DNA，妳需要Primer5軟件。擴增產物的長度可以自己設定。
如何使用PrimerPremier5軟件設計PCR引物-百度經驗()
如何在線設計Primer3？首先要看妳設計的底漆是幹什麽用的。如果用於普通PCR檢測或RealtimePCR，復制mRNA序列並選擇相應的大小。普通PCR的產物大小原則上控制在250~600bpRealtimePCR和100 ~ 200之間。最好爆破系統給出的引物對，選擇跨外顯子的引物對。
妳不需要太在意引物設計的經典規則，比如末尾GC%的個數。Primer3自己的設計算法很好，及時設計的引物有二聚體發夾結構，絕大多數情況下不會影響使用甚至非常好用。
如果是擴展的固定序列，基本不用用Primer3看GC%，平均沒有連續重復序列。這部分是另外壹點。
如何用Primer6.0設計引物？1.首先，選擇目標基因序列。對格式沒有要求，復制目的基因序列即可。
2.在文件目錄中打開“新建”,然後選擇“序列”。這裏的另壹個項目選項是導入文件的方式，即將目標基因保存為文件可以直接導入到文件中。復制壹般比較方便。
3.打開序列後，會彈出壹個粘貼框。只需粘貼剛才復制的基因序列，然後點擊下面的添加即可。
4.選擇上面帶有紅色和藍色箭頭的按鈕來設計引物。在設計開始之前，您可以更改設計參數，包括搜索的堿基範圍、引物長度、堿基數量、設計結果中顯示的引物數量等。
5.設置好參數後，點擊下方搜索，軟件開始分析設計。完成後，單擊確定。設計結果將顯示如下。
6.在結果中，藍色為前引物，紅色為後引物，Rating為引物的綜合評價得分。最上面也會顯示引物的優缺點，最好的是最好的，中等的是好的，最差的是差的。壹般選用的底漆最好或好，其他顯示器不可用。
7.右邊有兩個選項。AllPrimers可以查看多對可供選擇的不同引物。可以根據需要選擇具有合適位置和產物長度的引物。選擇後，您需要點擊下面的替換來替換它。
8.AllStructers可以查看當前所選引物的結構，如發夾結構、引物二聚體和重復堿基。
9.選擇好引物後，點擊下面的引物序列，然後右鍵彈出復制信息的選項，然後導出設計好的引物。您也可以將結果直接導出為文件。