I .臨床標本的收集和保存
血清(血漿)是ELISA測定最常用的臨床標本，有時唾液、腦脊液、尿液、糞便等標本也用於特定的檢測目的。目前臨床上由血清樣本確定的標誌物壹般包括感染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標誌物、激素、特殊蛋白、細胞因子、治療藥物等。對於用於激素和治療藥物測定的血清樣本的采集，應註意采集時間甚至體位都可能對測定結果產生影響。比如可的松在淩晨4-6點之間會有壹個峰值:生長激素、促黃體生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)都是以陣發性模式釋放。因此，需要在緊密相連的時間間隔內取幾份血樣，取其中值作為測量值。再如，由臥位改為站立位時，血清中腎素的活性會明顯升高。再比如治療藥物的檢測，要根據藥代動力學選擇最佳的驗血時間。用於檢測傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標誌物和特殊蛋白質的血清樣本的采集對時間和姿勢沒有影響，但在處理和保存時應考慮以下方面:
(1)註意避免嚴重溶血。血紅蛋白含有血紅素基團，具有類似過氧化物的活性。因此，在以HRP為標誌酶的ELISA測定中，如果血清樣本中血紅蛋白的濃度較高，在孵育過程中會很容易吸附在固相上，從而與後面加入的HRP底物發生反應而顯色。
(2)在樣本采集和血清分離過程中，應註意盡可能避免細菌汙染，因為細菌的生長，其分泌的壹些酶可能會分解抗原、抗體等蛋白質；其次，某些細菌的內源性酶，如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶，會對相應酶標記的測定方法造成非特異性幹擾。
(3)血清標本如經無菌操作分離，可在2 ~ 8℃保存壹周，如經細菌操作，建議冷凍保存。樣品的長期保存應在-70℃以下。
(4)註意避免冰凍血清樣本因斷電而反復凍融。標本反復凍融產生的機械剪切力會破壞標本中的蛋白質等分子，從而造成假陰性結果。另外，還要註意凍融標本的混合，不要劇烈振蕩，要反復混合。
(5)保存過程中如有細菌汙染造成渾濁或絮狀物，應離心沈澱後取上清液檢測。
二、試劑準備
在臨床實驗室中，試劑的制備壹般不受重視。通常的做法是將試劑從冰箱中取出，在實驗過程中立即使用，忽略了這種做法可能會影響日後孵育時間不足的問題，直接後果就是壹些弱陽性樣本會出現假陰性。所以在ELISA的試劑準備中，最重要的是在實驗開始前將試劑盒從冰箱中取出，在室溫下放置20分鐘以上，然後進行測量，這樣試劑盒在使用前就可以與室溫達到平衡。這樣做的目的主要是使反應微孔中的溫度在後續的孵育反應步驟中快速達到所需的高度，以滿足測定要求。其次，目前市售的酶聯免疫試劑盒中的洗板液在實驗室使用時需要用提供的濃縮液稀釋配制，所以稀釋用的蒸餾水或去離子水的質量要有保證。此外，當OPD用作試劑盒中的底物時，應在反應顯色前臨時制備底物溶液。
第三，添加血清樣本和反應試劑
在目前的商業ELISA試劑盒中，加入血清樣品幾乎是使用微量取樣器加入樣品的唯壹步驟。使用微量取樣器時必須註意的要點是:加樣不要太快，要避免加到孔壁上部，不要濺出和產生氣泡。太快了，無法保證微量添加的準確性和均勻性。加到孔壁上部未塗覆區域容易引起非特異性吸附。飛濺會汙染相鄰的孔。出現氣泡時，反應液界面不同。在國產試劑盒中，試劑基本都是從滴瓶中滴出。除了下落的角度，下落的速度也很重要。如果滴加過快，容易在兩個孔之間重復滴加或添加，會導致孔的未塗區域發生非特異性吸附，從而引起非特異性顯色。所以有時候同壹個試劑盒的壹個樣本，這次是陽性，下次是陰性，往往是由於上述添加樣本和試劑的錯誤造成的。
第四，溫暖教育
孵育是影響ELISA成敗的最關鍵因素。ELISA是壹種固相免疫分析方法，抗原和抗體的結合反應是在固相上進行的。為了使液相中的抗原或抗體與固相上的特異性抗體或抗原完全結合，必須在壹定的溫度下反應壹定的時間。孵化所需時間與溫度成反比，即溫度越高，所需時間越短。最常用的孵育溫度是37℃和室溫，其次是43℃和2 ~ 8℃。
孵育是臨床ELISA中最容易出現問題的。通常國產商用ELISA試劑盒的反應孵育時間為37℃30分鐘~ 1小時，而進口ELISA試劑盒的反應孵育時間通常為37℃1 ~ 2小時，可能會影響測定下限。因此，關於孵化，在實際測量操作中必須註意以下幾點:
(1)確保在設定溫度下有足夠的反應時間。壹般來說，加入樣品和/或試劑後，將微孔板從室溫下拿到水浴箱或培養箱中時，孔內溫度從室溫上升到37℃需要壹定的時間，尤其是室溫比較低且不處於水浴狀態時。然而，在臨床實驗室中，很少有人關註這個問題。通常微孔板壹放入培養箱就計時，這樣容易導致實際測量的孵育時間。南方某血庫的同事曾經提出過壹個問題，就是每年的冬天，總有壹個多月。在HBsAg測定的室內質控中，對衛生部臨床檢驗中心提供的1 ng/ml弱陽性樣本進行測定時，總是檢測不到。我不知道為什麽。這可能與我國南方冬季室內溫度低有關。此時微孔板轉移到培養箱後37℃孵育時間不夠，使弱陽性樣本為陰性。因此，為了保證在37℃下有足夠的孵育時間，檢驗科可以自行確定微孔板在本實驗室不同季節(不同室溫下)從室溫拿到培養箱後，孔內溫度達到37℃需要多長時間，從而適當延長板條在培養箱中的放置時間。具體是在板孔反應液中放置壹個小溫度計進行測量和觀察。
(2)培養溫度的選擇。在壹些ELISA試劑盒的說明書中，指出有兩個孵育溫度，比如壹個是37℃1小時，壹個是43℃45分鐘。從免疫分析中抗原抗體反應的性質來看，在較低溫度下長時間反應最完全。例如2-8℃下24小時。在較高的反應溫度下，由於分子運動的遺憾，反應時間縮短，對於分子含量較多的強陽性樣品的測定沒有問題，但對於分子含量較少的弱陽性樣品，有可能漏檢。因此，我們建議在臨床ELISA測定中應盡可能使用較低孵育溫度和較長反應時間的條件。
(3)消除“邊緣效應”。過去在使用96孔板的ELISA測定中，經常發現有“邊緣效應”，即外圍孔的顏色比中心孔的顏色深。這種“邊緣效應”的原因可能是96孔板的外圍孔和中心孔之間的表面或熱力學特性的差異。但也有研究證實，孵化中的熱力學梯度可能是根本原因。聚苯乙烯本身是不良的熱導體。在實驗室常規的ELISA測定中，當平板從室溫(通常在25℃左右)放入37℃的培養箱中，同時平板也被加熱時，周邊孔和中心孔之間可能存在熱力學梯度。因此，在使用水浴或向板孔中加入反應液時，將板和溶液加熱到孵育溫度(如37℃)，很容易消除“邊緣效應”，提高測定的重復性。
綜上所述，在臨床ELISA測定中，為了保證良好的測定效果，可以采用以下幾種簡單的方法來保證孵育條件，即盡量使用水浴，孵育時使微孔板浮在水面上，或者將浸過水的砂布放入大飯盒中的濕盒中，放入暖盒中， 由於板條孔底部直接與水或濕布接觸，在37℃和水浴箱或濕箱的高溫下，反應溶液的溫度可以隨溫室快速變化。
五，洗板子
固相免疫分析是壹種非均相免疫分析技術，需要通過洗滌操作將特異性結合於固相的抗原或抗體與反應孵育過程中吸附的非特異性成分分離，以保證ELISA的特異性。因此，洗板也是ELISA測定中極其關鍵的壹步。以HRP為標記酶的ELISA試劑盒中使用的洗滌液壹般是含有0.05%Tween20的中性PBS，Tween20是壹種同時含有親水基團和疏水基團的非離子去汙劑。其在洗滌中的作用機理是其疏水基團通過疏水相互作用與被動吸附在聚苯乙烯固相上的蛋白質的疏水基團形成疏水鍵，從而削弱蛋白質和固相的吸附。同時，在液相中親水基團和水分子的共同作用下，蛋白質可以從固相中分離出來，進入液相，從而達到去除非特異性吸附劑的目的。但是，由於抗體或抗原的包被通常是在堿性條件下通過與固相的疏水相互作用被動吸附在固相上的，所以要註意非離子去汙劑的濃度。洗板液中Tween20濃度高於0.2%，會脫附包被在固相上的抗原或抗體，影響檢測下限。
在臨床實驗室中，ELISA洗板壹般有兩種方式，即手動和洗板機。手動洗板是指每次反應孵育後，將反應液吸出或甩幹，然後將板孔灌滿洗滌液，靜置2 ~ 3分鐘後，將洗滌液吸出或甩幹，然後在吸水紙上拍幹。重復上述洗滌步驟3 ~ 4次，最後在吸水紙上拍幹，即可進行下壹步測定操作。用洗衣機洗板就是把上面的人工操作改成用洗衣機洗板。用洗衣機洗盤子的壹個特點就是每次洗完都拍不幹，所以液體殘留比較多。液體殘留少的洗衣機比殘留多的洗衣機需要更少的次數來徹底清洗板材。具體檢驗科用多少次洗衣機才符合要求？可進行以下簡單實驗:選擇4×8 HBsAgELISA包被板條，每隔2×8孔加入相同的弱陽性和陰性樣品，按試劑盒說明加入酶結合物，完成孵育。洗板孔時，第壹排洗1次，第二批洗兩次，第三排洗三次——直到第八排洗八次，加底物顯色測定。如果洗滌三次，則顯色不會改變，即洗滌三次的板孔的比色測定與洗滌四次和五次的板孔的吸光度相同，正/負值保持最大值。
第六，色彩開發
在目前市售的以HRP為標誌酶的ELISA試劑盒中，如果以TMB為底物，提供的底物是兩瓶應用液A和B；如果使用OPD作為基質，試劑盒提供使用前制備的OPD片劑或粉末。壹般市售試劑盒的顯色反應條件為37℃或室溫15 ~ 30分鐘。理論上，HRP的底物催化反應可在37℃下30分鐘內完成，盡管大部分催化反應可在最初的10分鐘內完成。因此，為使弱陽性樣品的孔充分顯色，建議在37℃下25 ~ 30分鐘後終止反應比色測定。
另外，在加入底物開始顯色反應前，最好檢查底物溶液的有效性，即在幹凈的空板孔或eppendorf管中加入壹滴溶液A和溶液B，觀察是否有顯色，如果有，說明底物已經變質。以OPD為底物，配制後應無色，否則不能使用。以TMB為底物，整個顯色反應過程不需要避光，而以OPD為底物，則需要避光。關於TMB和OPD的顯色反應特點和註意事項，請參見前面章節。顯色反應完成後，加酸終止反應，搖勻混勻後，即可進行以下比色測定或目測判斷。
七、比色
ELISA的比色測定是用酶標儀進行的。有的同事可能會覺得，既然是用酶標儀進行的，這個時候什麽都可以做。其實不是，因為更先進的酶標儀器有很多功能，如果使用不當，會得到無法理解的結果。比如用酶標儀比色測定後，很多陰性測定孔的吸光度值為陰性或者測定的假陽性率大大增加。這主要是由於沒有正確理解和使用酶標儀造成的。至於如何正確理解和使用酶標儀，請參考後面的相關章節。這裏，只強調以下兩點:
在測量(1)比色法時，壹定要註意酶標儀的波長是否調好了，或者使用的濾光片是否正確。在壹些臨床實驗室中，酶聯免疫測定同時使用TMB試劑盒和OPD試劑盒，而前者的比色波長為450nm，後者為492nm，因此需要根據需要隨時更換過濾器。因此，容易出現光學濾波器誤用的問題。
(2)單波長或雙波長比色選擇問題。中檔及以上的酶標儀器，基本上同時具備單波長和雙波長比色功能。所謂單波長比色測定，通常是在對顯色吸收最大的波長處進行，如450nm或492nm而雙波長雙色酶標儀是在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm處測量壹次，敏感波上下測得的吸光度是樣品測得的酶反應特定顯色的吸光度與板孔上指紋、劃痕、灰塵等汙垢造成的吸光度之和；在非敏感波長下測定，是指將波長改變到壹定值，使樣品的酶反應的特定顯色的吸光度值為零，此時測得的吸光度就是汙垢的吸光度值。最後，酶標儀給出的值是敏感波長處的吸光度值與非敏感波長處的吸光度值之差。因此，雙波長比色測定具有消除非特異性吸收、指紋、劃痕、灰塵等影響的優點。對滴板本身和樣品在板孔上的特定顏色的吸光度進行測定，壹般沒有必要設置空白孔。如果在使用雙波長比色法時仍設置空白孔，可能會造成上述測量孔吸光度為負值的現象。因為ELISA中單個空白孔的非特異性吸收存在壹定程度的不確定性，也就是說每次或同時可能得到不同的吸光度值，所以ELISA比色測定最好采用雙波長比色法。
八。結果的判斷
根據表達測定結果的方式，臨床ELISA測定可分為定性測定和定量測定。定性只是對標本是否含有待檢測的抗原或抗體作出“是”或“否”的結論，分別用“陽性”和“陰性”來表示。可見定性測定通常用於確定傳染性病原體的抗原或抗體，以判斷特定病原體感染的存在。定量測定是對標本中待檢測抗原數量的定量測定，用特定值表示。定量測定基本用於非病原體抗原物質的測定，如激素、細胞因子、腫瘤標誌物、小分子藥物等。目前國內臨床上使用的ELISA試劑盒大多用於感染性病原體抗原或抗體的定性測定，少數用於αFP、hCG、細胞因子的定量測定。ELISA定性測定中“陽性”和“陽性”的確定是以試劑盒確定的陽性測定值(臨界值)為基礎的。定量測定的“值”是基於通過同時測定試劑盒中的標準物質而獲得的劑量-反應曲線(也稱為標準曲線)。ELISA定性和定量結果的數據處理將在後面的專門章節中討論。這裏我只想強調的是，ELISA定性測定的“陰性”和“陽性”結果只能依據試劑盒本身測定的臨界值來判斷，不能使用衛生部臨床檢驗中心提供的弱陽性定值質控血清。為什麽要強調這壹點？這主要是因為很多基層實驗室用部中心供應的弱陽性定值質控血清(過去也叫“臨界值血清”)的吸光度來判斷結果，如果高於它就判定為陽性，否則為陰性，不考慮試劑盒的臨界值。至今仍有壹些實驗室堅持這種錯誤的做法。試劑盒臨界值的建立是基於壹系列的科學實驗和統計學研究(見後)，部中心提供的弱陽性定值質控血清主要用於臨床實驗室的室內質控。
接下來，我們將解釋ELISA定性結果確定中常用的壹些縮寫。
(1)S/CO:其中S是樣品或標本的縮寫，表示由標本確定的吸光度值，CO是截止值的縮寫。除競爭抑制法外，其他ELISA定性測定模式中，當S/CO值大於等於1時，樣本為陽性，小於1時，為陰性。
(2)S/N或P/N:其中S同(1)，N為陰性對照的簡稱，P為患者的簡稱。早期的很多試劑盒都是以S/N或P/N≥2.1為陽性標準，有些試劑盒至今還在使用這種方法。該方法與S/CO法無本質區別，只是前者以陰性對照(n)的2.1倍作為臨界值。
九。結果報告和解釋
臨床ELISA結果的報告相對簡單。定性測定可以是陰性也可以是陽性；定量測定報告具體數值。結果的解釋要復雜得多，需要實驗室技術人員對所測項目有全面的知識基礎。比如對乙肝“兩個半”結果的解讀，不僅需要檢查者知道不同結果模式的臨床意義，還需要對乙肝病毒的分子生物學、分子變異及其對表型的影響有更深入的了解。目前，檢驗已經不再是簡單的實驗室測量，而成為了壹門臨床醫學學科，即檢驗醫學，這就要求從事醫學檢驗的檢驗醫生不僅要知道自己在做什麽，還要知道自己為什麽要做，否則必然會被時代淘汰。
綜上所述，雖然ELISA測定的操作步驟很簡單，但可能影響測定結果的因素很多，分布在測定操作的各個步驟，尤其是加樣、孵育、洗板。為了幫助您分析和找到測定中出現問題的可能原因，下表總結了常見問題及其原因。
臨床ELISA測定中可能出現的問題及原因
提問
可能的原因(不是套件本身的原因)
1.無法檢測到弱陽性質控樣本。
孵化時間或溫度不夠；顯色反應時間太短；用來配制緩沖液的蒸餾水有問題。
2.測定的重復性差。
(同壹樣品的兩次測定結果不壹致)
這是由測定操作引起的典型問題，包括
(1)樣本添加和測試劑量不正確；孔與孔之間不壹致；
(2)加樣過快，孔間出現汙染；
(3)加錯樣本；
(4)添加樣品和試劑時，添加到孔壁上部的未塗區域；
(5)將不同批號的試劑盒中的組分混合；
(6)孵育時間、洗板和顯色時間不壹致；
(7)孔內被汙染的雜物；
(8)酶標儀的過濾器不正確；
(9)血清樣本在完全凝固前加入，反應孔內出現纖維蛋白凝塊或殘留血細胞，容易出現假陽性反應。
3.白色書寫板
(陽性對照不顯色)
(1)缺失的酶綴合物；
(2)洗滌液的配制有問題，如量筒不幹凈，含有酶抑制劑(如疊氮化鈉)。
(3)省略顯色劑A或B；
(4)終止劑用作顯色劑。
4.所有板孔都是彩色的。
(1)洗板不幹凈；
(2)顯色溶液變質；
(3)添加底物的吸收被酶汙染；
(4)洗滌液被酶汙染。