熒光快速檢測:生物傳感器的應用不是夢——訪中科馬良生物工程有限公司技術總監金貞花教授
ATP熒光法是根據螢火蟲發光原理發展起來的壹種快速檢測技術。螢火蟲發光是因為它們可以合成將化學物質的化學能轉化為光能的生物催化劑，如螢火蟲熒光素酶(簡稱熒光素酶)、D-熒光素和ATP(三磷酸腺苷，壹種所有細胞生物都能產生的能量物質)。在有氧條件下，熒光素酶催化熒光素產生氧化熒光素，並發出熒光。如果滿足以上條件，即使是螢火蟲以外的系統也能發出熒光。早在20世紀50年代末，美國國家航空航天局就利用螢火蟲熒光素酶建立了快速超微ATP檢測技術。20世紀60年代末，檢測出地球土壤樣本中的ATP，並應用於未來探測月球和火星上是否存在生命。基於昆蟲熒光素酶的ATP檢測的商業應用始於20世紀80年代末，最初是通過培養螢火蟲幼蟲來獲得熒光素酶。隨著基因工程技術的發展和應用，科學家從螢火蟲細胞中提取出編碼螢火蟲酶的基因，並將其導入細菌細胞。這樣通過生物發酵，短短十幾個小時就可以獲得大量的昆蟲熒光素酶。
2003年，中科馬良引進了中科院發展所金貞花教授發明的“含熒光素酶基因的新菌株及昆蟲熒光素酶的生產”專利項目。經過幾年的產業化探索，終於在2005年後開始批量生產具有自主知識產權的昆蟲熒光素酶和昆蟲熒光素酶制劑，並於2007年完成相關檢測產品的配套，實現了食品樣品中細菌總數的快速檢測。基於昆蟲熒光素酶的ATP熒光檢測原理只有當ATP存在時，昆蟲熒光素酶才能催化昆蟲熒光素酶的反應並產生熒光。因此，如果熒光素酶和熒光素酶太多，熒光強度將只取決於反應體系中ATP的量。以檢測樣本中的細菌為例，細胞越多，ATP越多，熒光越強。也就是說，在壹定條件下，熒光值與ATP的量成線性關系；此外，熒光值可以通過光度計容易且精確地測量。因此，在排除樣品中非細菌ATP幹擾的情況下，只要得到相對熒光值與細菌細胞數的關系曲線，然後根據純ATP的相對熒光值與細菌細胞數的標準曲線就可以快速確定樣品中的細菌細胞數。
ATP快速檢測系統的組成和功能目前，基於螢火蟲發光原理，用於生物量、酶和代謝物檢測的應用系統有很多。雖然各種檢測系統的應用目的、操作方法和樣品來源不同，但在組成上都包括以下幾個部分。
1.試劑系統試劑系統包括促進熒光反應所需的所有試劑和有效的ATP提取試劑。具體包括體細胞裂解試劑組、細菌細胞裂解試劑組和熒光反應試劑組。體細胞裂解試劑組可以特異有效地裂解樣品中的非細菌細胞(體細胞)並釋放出ATP，然後通過比色杯底部的濾膜將其去除。細菌細胞裂解試劑組的主要作用是有效裂解細菌細胞，釋放ATP進行檢測。同時，為了避免ATP降解，影響檢測結果的真實性，細菌細胞裂解試劑應能快速使ATP降解酶失活。熒光試劑組包括熒光素和能與樣品中細菌ATP相互作用並發出熒光的熒光素。
2.采樣器和樣品預處理裝置這部分包括可以定量獲取不同物理狀態下待測樣品的采樣器、對體細胞排出的ATP進行加壓的加壓器、反應用帶膜比色皿、樣品濃縮用杯架和專用濃縮器等。
3.顯微光度計顯微光度計，即微型熒光檢測儀器。根據具體需要，光度計除了具有用於測量和顯示熒光值的屏幕之外，還具有與個人計算機或自動打印機結合的外部接口，以便記錄和存儲用於產品質量或衛生監測趨勢分析的相關數據。
ATP快速檢測技術的優勢壹般來說，實現快速檢測依賴於待測樣品在反應過程中能夠產生易於檢測的聲、光、磁等信號。通過產生易於檢測的熒光來實現ATP熒光的快速檢測。在健康監測方面，具有常規檢測無法比擬的優勢。實踐和文獻資料都表明，利用快速檢測系統檢測到的熒光值，即總ATP值(來自細菌和食物殘渣的ATP)作為健康監測指標，無論是“時效性”還是實際效果，都要比目測或細菌平板計數好得多。因此，有人認為ATP總量可以作為判斷健康狀況好壞的標準。
1.采用快速準確的常規平板計數法檢測細菌總數，即使細菌在LB培養基上生長成肉眼可見的菌落。由於樣品稀釋不均勻，壹個菌落往往由兩個或兩個以上的細菌細胞組成，LB培養基只適合需氧或半需氧細菌的生長。所以只能得到這類細菌的數量。ATP熒光快速檢測法可檢測所有細菌、真菌、藻類，1-5分鐘即可得到實時檢測結果，操作簡單，時間短。平板計數法耗時1-5天，結果難以反映實際衛生情況。
2.樣本量小。由於熒光素酶對ATP非常敏感，通過發光反應可以檢測到0.1皮克分子(10-12摩爾)以下的ATP，因此可以用於檢測細菌含量較低的樣品。比如0.45um膜過濾滅菌的啤酒中細菌含量很低，用常規方法檢測不出來，而用ATP熒光濃度可以檢測出來。ATP快速檢測技術的應用“ATP熒光快速檢測系統”自20世紀90年代開始用於全程監測。根據螢火蟲發光原理研發成功並投放市場的產品有很多。如中科馬良研發的ATP熒光快速檢測系統，可用於食品、飲料、乳制品的全過程監控:在生產加工前，可用於檢測生產設施的清洗消毒效果和原料中的細菌總數；在加工生產過程中，可用於生產設備關鍵控制點(如供水、通風閥門)的衛生學監測，影響乳品發酵飲料、酒類中特殊微生物總數的檢測；經加工生產後，可用於檢測成品中的汙染菌總數。此外，還可用於環保、水政、海關、檢疫等執法部門對各種樣品中微生物(細菌總數)的快速檢測。ATP快速檢測在HACCP中的應用通過對食品生產線或周邊衛生環境的研究發現，如果用平板計數法得到的生產線上某壹點的細菌總數很少或無菌，而用ATP熒光檢測法得到的ATP值很高，那麽該檢測點後期容易滋生大量微生物。經過分析，認為ATP熒光檢測得到的總ATP值來自殘留物和微生物。並且在大多數情況下，來自微生物的比例很小。所以可以通過ATP熒光檢測的ATP值來判斷檢測點是否會再次被汙染，而不是根據細菌細胞的ATP值換算的細菌菌落總數，但關鍵是要確定不同生產線不同檢測點的ATP臨界值。基於此，發達國家已經在HACCP中使用ATP熒光檢測來評價食品原料和清洗消毒後的食品原料接觸表面是否符合衛生標準。然後重點監控容易造成微生物汙染的關鍵部位。比如通過ATP的快速檢測，可以判斷從常規消毒到新生產的間歇時間內是否存在汙染的可能；然後，制定出既符合本單位情況，又符合衛生要求的ATP數值範圍。袖珍式ATP快速檢測儀的應用目前袖珍式ATP快速檢測儀已經應用於生活的方方面面，在食品方面的應用主要是檢測餐廳和火車上的餐具衛生狀況。中國鐵道部決定，在2008年奧運會前，在列車上使用沈陽中科馬良生物工程有限公司的便攜式快速檢測儀，替代間接氯離子檢測法進行餐具衛生檢驗。此外，基於熒光素酶的ATP快速檢測還可應用於其他領域和用途，如自來水檢測、桶裝水無菌檢測、軍事野戰飲食中的炭疽檢測、環境監測、臨床檢測等。