實驗總結
通過TRIzol提取樣品的總RNA，通過逆轉錄獲得cDNA用於下遊實驗。
1.試劑和消耗品
試劑和消耗品
prime Script II 1st strand cDNA合成試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司，6210B；；總RNA提取試劑TRIzol，南京中鼎生物科技有限公司，rk 01-100；
DL2000 DNA加標記(100，250，500，750，1000，1500，2000 bp)，南京諾沃贊生物科技有限公司，MD101。GelStain，北京全食金生物科技有限公司，GS 101-01；
DEPC，適馬公司，d 5758-25ml；；瓊脂糖，Biowest，西班牙，91622；
離心管，美國Axygen，311-01-051；槍頭，Axygen，美國；
其他試劑在中國都是分析純。
2.主要實驗儀器
主要實驗儀器
超微紫外分光光度計:NanoDrop2000，Thermo公司；臺式高速冷凍離心機，貝克曼公司，Allegra 21R；；
電子天平，AHOMS公司，ar 5120；；紫外線透射儀，Amersham Pharmacia公司，Hofer MV-25；
電泳儀:TY2795，BIO-RAD公司；電泳槽:亞細胞GT細胞，BIO-RAD公司；
凝膠成像分析系統:GelDocXR型號，BIO-RAD公司；雪花制冰機，日本三洋公司，SIM-f 140 ay 65；
移液器，德國Eppendorf。
3.實驗方法和結果
3.1.RNA提取
(1)組織勻漿:向樣品中加入1 ml TRIzol試劑(組織塊的體積不應超過TRIzol體積的10%)，用移液管反復吹氣。
(2)將勻漿在室溫下放置5分鐘，直到核酸和蛋白質完全解離。將0.2 ml氯仿加入到1 ml TRIzol試劑用量的均質漿液中，蓋緊試管蓋，手動劇烈搖動15 s，然後在室溫下靜置2 ~ 3 min。
(3)在4℃下10，000克，離心10分鐘。
(4)小心吸取上層水相(無色)並加入新的試管中，同時計算吸取水相的體積。
(5)加入等體積的已預冷的異丙醇，蓋緊管蓋，輕輕搖動。
(6)在室溫下靜置65438±00分鐘，直到RNA完全沈澱。
(7)在4℃下將10，000 g離心10分鐘。
(8)棄去上清液(註意不要棄去沈澱)，向每個試管中加入1 ml的75%乙醇，蓋緊試管，輕輕搖動離心管，除去殘留的異丙醇和鹽。在4℃下以7,500離心5分鐘
(9)棄去上清液，打開管蓋，沈澱並幹燥RNA(在室溫下揮發或真空幹燥)。註意，RNA沈澱不能完全幹燥，否則很難溶解。
(10)將RNA沈澱溶解在適量不含RNA酶的水中。
3.2.RNA瓊脂糖凝膠電泳分析
提取的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖譜如下:
3.3.RNA濃度和純度測試
3.4.RNA逆轉錄成cDNA
3.4.1.基因組DNA去除
使用來自中鼎公司的DNase I，在不含RNase的離心管中制備以下混合溶液:
3.4.2.逆轉錄反應
在PCR試管中準備以下反應混合物:
在65℃下反應5 min，然後在冰浴中冷卻。
在第壹步的反應管中制備如下逆轉錄反應溶液:
逆轉錄反應的條件為:30℃ 10分鐘，42℃ 30分鐘，95℃ 5分鐘。冰浴冷卻。該產品儲存在-20℃的冰箱中。
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