1)什麽是凝膠遷移或電泳淌度實驗？
凝膠遷移或電泳遷移實驗(EMSA)是壹種研究DNA結合蛋白與其相關DNA結合序列之間相互作用的技術，可用於定性和定量分析。該技術最初用於研究DNA結合蛋白，現在已用於研究RNA結合蛋白與特定RNA序列的相互作用。
通常，將純化的蛋白質、細胞粗提物和32P同位素標記的DNA或RNA探針壹起孵育，在非變性聚丙烯凝膠電泳上分離復合物和未結合的探針。DNA復合物或RNA復合物比未結合的探針移動得更慢。根據所研究的結合蛋白，同位素標記的探針可以是雙鏈的或單鏈的。當檢測DNA結合蛋白如轉錄調節因子時，可以使用純化的蛋白、部分純化的蛋白或細胞核提取物。當檢測RNA結合蛋白時，根據靶RNA結合蛋白的位置，可以使用純化或部分純化的蛋白或細胞核或細胞質細胞提取物。在競爭實驗中，DNA或RNA片段和含有蛋白結合序列的寡核苷酸片段(特異性)和其他不相關的片段(非特異性)用於確定DNA或RNA結合蛋白的特異性。在存在競爭性特異性和非特異性片段的情況下，特異性結合根據復合物的特征和強度來確定。
2)這樣的實驗需要什麽試劑？
凝膠遷移實驗所需的結合蛋白可來源於純化或部分純化的蛋白或粗細胞核和細胞質提取物。還必須制備同位素標記的DNA或RNA。通常，DNA核苷酸探針用g-32P和T4多核苷酸激酶標記，同位素標記的RNA用噬菌體RNA聚合酶和同位素標記的核苷酸在體外合成。Promega的核糖探針？/sup系統(a，b)(目錄號P1420、P1430、P1440、P1450、P1460)可用於體外合成同位素標記的RNA，以及DNA 5′-末端標記系統(目錄號u20)結合反應所需的成分有:鹽水溶液(氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀)、緩沖系統(Tris-HCl或HEPESDI:dC)，也可以含有非離子洗滌劑。結合蛋白與同位素標記探針作用後，在非變性聚丙烯凝膠電泳上分離出復合物，然後凝膠幹燥放射自顯影，或者凝膠與磷光圖像壹起使用？/sup分析。
3)凝膠遷移實驗系統提供了哪些試劑？
Promega公司提供了檢測DNA結合蛋白的凝膠遷移實驗系統，可作為此類實驗的陽性對照。該系統包括靶寡核苷酸、對照DNA結合蛋白、結合緩沖液和寡核苷酸探針末端標記所需的試劑。核心系統(目錄號E3050)包括含有重組AP2蛋白的大腸桿菌提取物(AP2提取物)和AP2的同源寡核苷酸。AP2提取物是從表達AP2蛋白的大腸桿菌中提取的。此外，核心系統還包含SP1同源寡核苷酸、凝膠遷移結合緩沖液(5’)，以及可用於20個對照實驗的HeLa核提取物。完整系統(目錄號E3300)包含五個其他雙鏈寡核苷酸，它們是AP1、OCT1、CREB、NF-kB和TFIID的結合位點的同源序列。這些寡核苷酸可以在末端標記後用作特異性探針，或者在競爭性實驗中用作非特異性探針。更多信息請參考凝膠遷移實驗技術手冊TB110。
4)凝膠運移實驗成功需要優化哪些因素？
凝膠遷移實驗理論上簡單快速，但要成功進行凝膠遷移實驗，需要優化壹些參數，這些參數主要受結合蛋白來源和探針結合位點特性的影響。以下因素需要優化:提取液的制備(核酸酶和磷酸酶汙染會使探針降解)、結合蛋白濃度、探針濃度、非特異性探針濃度、緩沖液的配方和pH、聚丙烯凝膠電泳的特性和電泳條件、孵育時間和溫度、載體蛋白、是否有輔助因素(如鋅、鎘等金屬離子，或激素)。簡而言之，總反應體積應該是最小的(20ul)。為了滿足壹般要求，結合緩沖液含有4%甘油、1mmgcl2、0.5mm EDTA、0.5mm DTT、50mm NaCl、10mm tris-HCl (pH 7.5)和0.05mg/ml聚(di: DC)？dI:dC，或者10mm Hepes (pH 7.9)，50mmkcl，1mm DTT，1mm EDTA，10%甘油，0.05mg/ml聚(DI:dC)？DI:dC可以作為優化實驗的開始。更多信息請參考凝膠遷移實驗技術手冊TB110。
5)提供了哪些同源多核苷酸引物，這些引物的序列來源是什麽？
dsDNA探針種類繁多，包含各種轉錄調控因子的同源結合位點。下表列出了可用的探針和這些引物序列的來源。
轉錄調節因子探針
-
探針名稱目錄編號序列(纏繞)序列的來源
Sp1e3231，e 32325′-att CGA TCGGGGGGGGGGGCG-3′SV40啟動子(1)
AP 1e 3201e 32025′-cgcttgatgatcagccggaa-3′膠原酶基因TRE(2)
ap2e 3211e 32125 '-gatcga act廣汽CGCC CCG CCG GT-3 '人金屬硫蛋白II a(3)
基因NF-KB E3291，E3292，5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3′小鼠Igk輕鏈基因(4)
oct 1e 3241e 32425′-TGT CGA ATG CAA ATC act aga A-3′ig重鏈基因(5)
CREB e 3281e 32825′-agagat TGC CTG ACG TCA GAC AGC Tag-3′大鼠生長激素抑制基因(6)
tfi id e 3221e 3222 5′-GCA gag cat ATA agg TGA gg taga-3′Belta-1球蛋白啟動子。
僅列出了上鏈序列，探針是雙鏈的，下鏈序列與上鏈序列配對。粗體表示序列來源於特定的基因序列，由轉錄調節因子結合的序列用下面的線表示。壹般來說，周圍的核苷酸是任意的。
DNA探針的選擇需要考慮哪些重要因素？
目標DNA的長度應該小於300bp，以便於未結合的探針和蛋白質DNA復合物的電泳分離。雙鏈合成寡核苷酸和限制性酶片段可用作凝膠遷移實驗中的探針。如果已經鑒定了靶蛋白，則使用短的寡核苷酸片段(約25bp ),以便可以將結合位點與其他因子的結合位點區分開。長限制性片段可用於定位推定的啟動子/增強子區域中的蛋白質結合位點。隨後，DNaseI印跡可用於在DNA序列水平上分析蛋白質結合的特定區域。
7)能與下列轉錄調節因子和HeLa核提取物形成什麽復合物:ap1，AP2，CREB，nfkb，oct 1，sp1，tfiid，tfiib。
當HeLa核提取物作為結合蛋白的來源時，每1個轉錄調控因子與其相關的DNA同源序列結合形成特征性的結合形式。下文描述了每壹種轉錄調節因子，包括公認的同源序列、因子的大小、特異性結合條件以及可與HeLa核提取物形成的復合物的數量。
1.ap1: ap1(激活蛋白1)是壹種轉錄調節子，其結合同源序列為5′-TGA gtca-3′。當AP1的結合位點存在於基因的啟動子區域時，這些基因可以被誘導，例如蛋白激酶C (2，7)可以被佛波酯誘導。在細胞中，AP1形成c-Jun或Jun相關蛋白的同二聚體，或c-Jun或Jun相關蛋白和c-Fos或Fos相關抗原(Fras)的異二聚體。Fos蛋白本身不能形成同型二聚體，不能單獨與AP1結合位點結合。C-Jun蛋白是壹種40kDa的單體蛋白，通過亮氨酸拉鏈形成同型二聚體。在HeLa細胞中，AP1的主要形式是c-Jun蛋白的同型二聚體。在凝膠遷移實驗中，形成了特定的復合物。在確定AP1的活性作為凝膠遷移實驗時，除了基礎溶液成分外，0.01mg/ml聚(dI:dC)？Di: DC)，向結合緩沖液中加入100 ug BSA和5 mm DTT。如果使用純化的蛋白質，則使用1-2ug蛋白質來檢測遷移復合物。
2.AP2: AP2是壹種轉錄調節因子，可分別用作TPA-和cAMP-誘導因子(10)。它是壹種52 kDa的蛋白質，公認的同源序列是5′-CCCGGC-3′或5′-GCCCNNGGC-3′(3)。這種因子對視黃酸特別敏感，並可能在形態發生中起重要作用。HeLa核提取物與AP2同源DNA探針形成特異性復合物。當純化的蛋白質用於凝膠遷移實驗時，使用20-50ng的蛋白質。
3.CREB: CREB是壹個37 kDa的轉錄調節子，識別響應cAMP的5′-t(g/t)ACG TCA-3′DNA(6，11)的同源序列。包含亮氨酸拉鏈結構以形成同型二聚體，相關的基本結構域與c-JunDNA結合結構域同源。當使用HeLa核提取物時，它可以與CREB同源序列形成復合物。
4.NF-KB: NF-KB最初被鑒定為與B細胞中免疫球蛋白K輕鏈的增強子結合。但後來在非B細胞的細胞質中發現，形成NF-kB和IkB的復合物。最初從DNA結合蛋白復合物中分離的NF-kB是由p65(RelA)和p50組成的異二聚體。其他分離的單體包括p49(也稱為p52)、p75 (c-rel)和p68 (relb)。單體p65、p68和p75起反式激活作用。P50和p49(p52)單體具有DNA結合活性，但僅有少量反式激活。據報道，p49和NF-kB單體p65形成具有轉錄活性的異源雙鏈體，類似於p50/ p65異源雙鏈體。P49/ p65和p50/ p65異二聚體在細胞質中由壹種叫做IkBa/MAD-3的抑制劑調節。IkB和p65單體的結合阻止了在細胞核中的定位和DNA的結合。在體外，高濃度的p65可以形成同型二聚體，其可以與DNA弱結合。聚(dI:dC)可以抑制這種反應(14)。P49和p50也能形成同源二聚體，但在細胞中的濃度很低。通常在NF-kB的凝膠遷移實驗中，在20ul的反應體積中有0.28皮摩爾的NF-kB9寡核苷酸(pH 7.9)，50 mm MKCl，0.2 mm EDTA，2.5 mm DTT，65，438+00%甘油和0.05% NP-。當使用純化蛋白時，250-300ng足以形成凝膠遷移復合物，而需要10ug的HeLa核提取物。凝膠遷移復合物在室溫下孵育30分鐘，凝膠遷移復合物在7%聚丙烯酰胺凝膠電泳中用50mMTris(pH8.3)和38mM甘氨酸分離。含有考馬斯藍和二甲苯藍色素的樣品溶液只能加入到陰性對照反應中，因為這兩種色素會加劇NF-kB復合物的解離。當HeLa核提取物用作結合蛋白源時，可以形成兩種序列特異性凝膠遷移復合物，即p50/p50同二聚體和p50/ p65異二聚體。在表達p49、p50和p65的細胞中可以檢測到四種序列特異性凝膠遷移復合物(p49/P49、p50/P50、P50/p65、p49/ p65)。如果有高濃度的P65，可以檢測到少量的p65/p65。以下試劑可在體外增強NF-kB的結合:mM GTP、ATP、精胺、亞精胺、鋇或鈣離子、ng Co+3(NH3)6(12)。
5.OCT 1: OCT 1是OCT轉錄調節子家族的壹員，顯然廣泛存在於哺乳動物細胞中(5)。POU域包括POU盒和同源域。當使用HeLa核提取物時，可以檢測到與OCT1同源探針形成的序列同源凝膠遷移復合物。
6.Sp1: Sp1是壹種O-糖基化轉錄調節因子，識別長度為10個核苷酸的同源序列5′-GGGGGGGGGC-3′(1)。核心識別序列為5′-GGGGGGGGG-3′。與核心序列相似的序列通常存在於啟動子中。壹個例子是SV40的早期啟動子，它是第壹個能與SP1結合的啟動子。根據糖基化的不同，其分子量為95-105kDa，DNA結合域的三個鋅指紋決定了序列的特異性。HeLa核提取物與SP1同源探針形成特異性凝膠遷移復合物。
7.tfiid/TFIIB: tfiid和TFIIB是基礎轉錄調節子，參與RNA聚合酶II啟動子(16)的基礎轉錄。TFIID與真核啟動子的TATA區形成特異性DNA結合。TFIID由幾種蛋白組成，其中TATA結構域結合蛋白(TBP)參與TATA序列的結合。TFIID的其他蛋白質成分被稱為TBP相關因子(TAFs)。用TFID探針寡核苷酸和HeLa核提取物可得到壹條弱的凝膠遷移帶，但很難鑒定為TFID序列特異性凝膠遷移復合物。純化的重組TBP很難做凝膠遷移實驗，部分原因是由於TBP帶很強的正電荷，使得TBP/DNA復合物很難進入凝膠。純化的TBP形成二聚體後不能與DNA(17)結合。因此，形成的二聚體可以參與DNA結合。TFIIB不單獨與DNA結合，但在與TFIID結合後，它增強了與DNA的結合。
在TFIIB與前啟動復合物結合後，RNA聚合酶II和TFIIF與轉錄起始區結合。因此，TFIIB在啟動前復合體的形成中起著重要的作用。當純化的TFIID用於凝膠遷移實驗時，不需要向結合反應中加入聚(dI-dC)。結合緩沖液含有10%甘油、20 mm tris (pH 8.0)、10 mm MgCl2、2 mm DTT和89 mm KCl。聚(dG:dC)可以加入到TFIID的凝膠結合實驗中。dG:dC .形成的復合物用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，凝膠成分為:0.5'TBE，6%聚丙烯酰胺凝膠(19:1丙烯酰胺:二分法)，4 mmg cl 2，0.02%NP-40，電泳緩沖液成分為:0.5'TBE，4mMMgCl2。當研究含有TFIID和TFIIB的復合物時，應從結合緩沖液、凝膠和電泳緩沖液中除去MgCl2。這些是壹般要求。當使用不同的細胞提取物、TFIID和TFIIB形成復合物進行凝膠遷移實驗時，要優化許多因素以達到理想的條件。
8)在凝膠遷移實驗中使用多少蛋白質或提取物和標記的DNA探針？
對於每種特異性結合蛋白和探針，需要優化所用的純化蛋白、部分純化蛋白和粗核提取物。壹般純化蛋白的用量在20-2000ng之間，蛋白與DNA的等摩爾比可以調整到DNA的5倍。對於粗核提取物，需要1-20ug蛋白質來形成特異性復合物。反應加入的探針量為50，000-200，000 CPm32 P標記探針(高比活性)，反應體積為65，438+0-5 ul。這相當於10-50毫摩爾的DNA探針。探針應儲存在-20℃以防止降解，並且必須在合成或標記後的1-2周內使用。探針和結合蛋白都應避免反復凍融。
9)體外翻譯可以制備蛋白質嗎？
Promega並沒有對所有的轉錄調節因子進行這樣的測試。通常，小麥胚芽提取物用於哺乳動物轉錄因子或DNA結合蛋白的體外翻譯，兔網織紅細胞裂解物可能含有內源性哺乳動物轉錄因子或DNA結合蛋白。但是TNT呢？/sup & gt；用兔網織紅細胞裂解系統(a、b、c、d)與超越TM生物素標記的tRNA(目錄號E3201)壹起翻譯轉錄調節子AP1(c-Jun)，制成AP1同源寡核苷酸(目錄號E3201)。TNT？/sup & gt；T7偶聯的小麥胚芽提取物(b，c，d，e)在體外翻譯c-Rel。這種蛋白質特異性遷移免疫球蛋白K輕鏈增強子的探針。加入體外翻譯成c-Rel結合反應的MAD-3(IKB家族成員)可以幹擾其相互作用。
10)聚(dI:dC)？DI:dC)，非特異性競爭DNA和特異性競爭DNA的作用是什麽？
它由肌苷和胞嘧啶組成。由於其特殊的結構，可以抑制蛋白質與標記探針的非特異性結合，避免假復合物。在凝膠遷移反應中加入聚(dI:dC)？DI:dC)能抑制粗核提取液中其他DNA結合蛋白的結合，如轉錄調節因子的非特異性結合。純化蛋白用於凝膠遷移反應時，不需要加入聚(dI:dC)？DI:dC)，如果添加的話，普通反應使用的最終濃度不會超過50-100ng。對於核提取物，每2-3ug核提取物使用1 ug聚(dI:dC)？dI:dC).為了確定形成的復合物的特異性，在有或沒有遞增的非放射性特異性競爭性DNA或非特異性競爭性DNA的情況下進行結合反應的競爭性實驗。壹般來說，非放射性特異性DNA是未標記的DNA探針，非特異性競爭性DNA，與DNA探針具有相同的長度組成，但序列不同。能與非放射性特異性DNA競爭但不能與非特異性競爭性DNA競爭的復合物表明靶蛋白和同位素標記探針的特異性結合。非特異性結合可以被特異性DNA和非特異性競爭性DNA競爭。結合液中的聚(dI:dC)？DI:dC)需要優化，但壹般用0.05mg/ml。非放射性(特異性或非特異性)競爭性DNA的劑量也需要優化或滴定，但競爭性DNA通常是同位素標記探針的10-1000倍(w/w)。其他類型的競爭性DNA，如小牛胸腺DNA，不能用於凝膠遷移反應，它們將攜帶目標蛋白的結合位點。
11)什麽樣的凝膠條件用於分離蛋白質/探針復合物和遊離探針？
將結合蛋白或粗核提取物與靶探針結合，蛋白/探針復合物和遊離探針可以通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。聚丙烯酰胺的濃度壹般為6% (30: 1丙烯酰胺:二元)，在壹定條件下可以使用高濃度或低濃度。PH、聚丙烯酰胺的濃度和丙烯酰胺與二嵌段丙烯酰胺的比例將影響凝膠中復合物的遷移。10-15伏的電壓用於大多數蛋白質，短時間高電壓(30-35伏)的電壓用於快速解離的蛋白質。電泳中使用的TBE和TAE必須是新制備的，沒有沈澱。丙烯酰胺基質的低離子強度和“盒效應”有助於復合物的穩定性。TGE緩沖液(12.5mMTris，pH8.3，95mM甘氨酸，0.5mMEDTA)也可用於不穩定的蛋白質/DNA復合物。結合和電泳實驗可在40℃下進行，以防止不穩定復合物和探針的解離。樣品溶液中的色素會導致不穩定絡合物的離解，因此應使用不含考馬斯藍和二甲苯藍的樣品溶液。當帶型不緊密，出現拖尾時，說明化合物解離。凝膠必須完全聚合以避免條帶拖尾。如果復合物沒有進入凝膠，則表明使用的蛋白質或探針過量，或者鹽的濃度對於該反應來說太高。含提取物的試紙條中沒有遊離探針或復合物，而只含探針的試紙條中有探針，說明提取物被核酸或磷酸酶汙染，所以在提取物中和結合反應中要加入相應的抑制劑。目前可以用高強度瓊脂糖凝膠分離蛋白質/探針復合物(比喻？/sup/瓊脂糖).
12)如何確定特定化合物中存在壹種蛋白質？
部分純化的蛋白質或粗核提取物和特異性探針可以形成壹種或幾種特異性蛋白質復合物。多重復合物的存在表明蛋白質降解，在制備提取物的溶液中和結合反應中應加入蛋白酶抑制劑。可能很難確定復合物中蛋白質的特征，但有壹些方法可以研究它。如果有針對目標蛋白的抗體，可以進行超遷移實驗，抗體與蛋白/探針復合物中的蛋白結合，延緩復合物的遷移，形成超遷移。在結合反應中加入增量抗體。抗體可以在與探針反應後加入到蛋白質中，或者提取物可以在加入探針前與抗體結合。根據抗體的特定抗原決定簇，前者有利於形成超遷移復合物，後者則阻止復合物的形成，導致原復合物強度降低。大部分實驗都要滴定抗體，抗體與蛋白質的摩爾比為1: 1，然後增加抗體的量。當存在純化的蛋白質時，它們可以與實驗的條帶遷移復合物進行比較。除了超遷移實驗，還可以通過紫外交聯和標記轉移來分析復合物中蛋白質的特征。在均壹標記探針和核提取物孵育後，復合物通過紫外線照射交聯，然後未保護的探針通過DNase降解。需要均勻標記的探針，因為脫氧核糖核酸酶會從末端標記的探針上除去標記。通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離由幾個保護的核苷酸交聯的蛋白質，幹燥並放射自顯影。結合蛋白的分子量可以與標準分子參照進行比較。蛋白質印跡分析也可以在具有靶蛋白抗體的復合物上進行(20)。如果蛋白質與DNA探針的特定序列結合，它可以通過含有保守結合序列和突變體的競爭性寡核苷酸來表征。定點突變也可用於改變保守序列的結合位點，以研究復合物的形成。
參考數據
1.Briggs M R等人1986科學234，47
2.李W等人1986細胞49，741
3.威廉姆斯T等人1989基因開發2，1557
4.森R和巴爾的摩D 1986 46，705號牢房
5.Parlsow T G等人1984美國國家科學院院刊81，2650
6.Montminy M R等1986美國國家科學院院刊83，6682
7.安吉爾·P等人，1987，49，729號牢房
8.趙等人1988細胞54，541
9.Rauscher F J等人1988細胞52，471
10.Imagawa M等人1987細胞51，251
11.Berkowitz L A和Gilman M Z 1990美國國家科學院院刊87，5258
12.Bauer le P A 1991生物化學生物物理學報1071，63
13.Duckett C S等人1993分子細胞生物學13，1315
14.都市M B等人1991 EMBO J 10(7)，1817
15.Dynan W S和Tjian R 1983單元格35，79
16.Peterson M G等人1990科學248，1652
17.Coleman R A等人1995生物化學雜誌270，13842
18.貝克勒G和赫斯特