關鍵詞:l 9981；基因芯片；基因表達；Nm23-H1基因
中國圖書館分類號:R734.2；Q813.1
文件識別碼:a
貨號:1007-7847(2006)01-0077-05。
nm23-H1基因已被證明是腫瘤轉移抑制基因。將nm23-H1基因的cDNA轉化到缺失nm23-H1基因表達的人高轉移大細胞肺癌細胞系L9981中，可以逆轉其惡性表型。然而，nm23-H1抑制肺癌侵襲和轉移的分子機制尚不十分清楚。我們前期的研究表明，nm23-H1基因對腫瘤侵襲和轉移的抑制作用可以通過調控轉移相關基因來實現。為了進壹步研究nm23-H1的分子機制，我們用基因芯片檢測了nm23-Hl對L99865438的轉染情況。
1材料和方法
1.1材料
l，1.1細胞系
1)L9981(高轉移大細胞肺癌細胞系)；2) L9981-nm23-H1(穩定表達nm23-H1基因的L9981細胞系)。全部由四川華西醫院肺癌分子重點實驗室提供。
1.1.2常用試劑和設備
精制小牛血清和RPMI t640培養基購自Hy- clone公司。用1.20 mmol/L的NaOH溶液配制成1 mmol/L的儲備液，儲存於4℃。上標TM II核糖核酸酶H-逆轉錄酶(1氮催化。編號18064-014)、dATP、dGTP、dCTP、dTYPOligod(T)引物(Bioasia Synthesis)、Cy5 (Amersham，Cat，編號PA55021)、Cy3(阿默舍姆，貓。編號PA53021)、RNA抑制素(Takara，Cat。編號D2311A)、Ola快速核苷酸可拆卸試劑盒(OIAGEN，Cat，編號28306)基因機:OmniGrid 100Pixsys5500芯片打印僅從Carte― sian公司購買，ScanArrayLite芯片掃描儀及其分析軟件Quantarray從GsiLumonics公司購買，載玻片和芯片的混合盒從Coming公司購買。
1.1.3基因芯片
項目使用的芯片版本號為2.2人類cDNA基因表達譜芯片，產品目錄號為SBC-R-HC-100-22，芯片編號為17874、17873(上海生物芯片工程公司)。
1.2方法
從1.2.1中純化總RNA
(RNeasy Mini Kit)總RNA用QIAGEN RNeasy Kit純化。詳細操作原理和方法參見rn easy Mini protocol 01。
1，2，2總RNA的質量檢測
(Labonchip檢測)具體操作步驟參見人類cD- NA表達譜芯片用戶手冊，SBC-H-HC-100-22，詳細結果參見樣本質量檢測報告。芯片實驗室參照Agi- lent 2100分析儀操作手冊，制備凝膠，根據軟件提示進行RNA電泳操作，評估RNA質量。
1.2.3樣品制備
用Sau3Al消化CDNA，然後用接頭連接，然後用PCR通用引物擴增。PCR產物用PCR產物純化試劑盒純化，取出500 ng。實驗標記方法為cDNA直接標記法，實驗組RNA (L9981-nm23-H1)用cy3熒光標記，對照組RNA (L9981)用cy5熒光標記。加入Cy3/ Cy5標記的引物(100 LLM 01/L)21LL(用NaOH處理的對照組用Cy5標記，用As20處理的處理組用Cy3標記)，然後在相同條件下進行PCR擴增和純化，將PCR產物的終濃度調整為200 mg/L。
1，2.4雜交
95℃變性後，將標記樣品加到預雜交芯片陣列表面，蓋上蓋玻片，置於雜交盒中，42℃雜交18h。
1.2.5檢測和分析
芯片結果用安捷倫掃描儀掃描，掃描分辨率10μm，PMT 100%%數據用Ima- gene軟件讀取。最後用Genespring進行歸壹化分析，最終比值為cy3/cy5，即實驗組/對照組。差異基因的篩選標準為(1)比值>:Or =2為上調基因，比值= 0.5為下調基因。
1.3的統計分析
聚類分析方法。利用genespring和聚類分析軟件進行聚類分析。
2個結果
2.1細胞總RNA電泳圖譜
兩個細胞系(L9981、nm23-H1和L9981)的總RNA提取純化後，1%瓊脂糖凝膠電泳可見明顯的28、18和5S條帶，28S條帶明顯比18 S條帶亮
2.2基因芯片雜交結果及分析
然後將Cy5和Cy3的掃描圖像完全重疊，在得到的雜交圖譜中(圖2)，紅點表示低表達，綠點表示高表達，黃點表示表達水平沒有變化。經過軟件分析，得到芯片雜交的散點圖(圖3)。每個點的y軸代表Cy3雜交信號的相對強度，x軸代表Cy5雜交信號的相對強度。45度直線上的點(實線所示)的Cy5/Cy3比值為L，表示沒有差別，遠離45度直線的點表示差別較大，落在兩條虛線外的點為Cy3/Cy5比值大於2或小於0.5的點。
2.3基因芯片篩查結果
nm23-H1基因轉染L9981細胞前後，共有***l792個基因，其中表達增加(上調)至1156，表達減少(下調)至642。在上調的基因中，有1038個基因功能未知。其中細胞周期和雕亡相關基因31，癌基因0，腫瘤抑制基因18，轉移相關基因12，細胞因子和轉錄因子13，細胞信號和蛋白相關基因38，細胞外基質和細胞骨架蛋白9，其中功能有541。但已知基因有101個，其中與細胞周期和雕亡相關的基因有12個，與癌基因相關的基因有11個，與抑癌基因相關的基因有3個，與轉移相關的基因有14個，與細胞信號和蛋清相關的基因有21個。
3討論
nm23-H1基因是壹種腫瘤轉移抑制基因，其低表達和缺失與肺癌的侵襲和轉移密切相關。我們前期的研究發現，nm23-Hi基因蛋白和mBNA的低表達、突變和等位基因缺失與肺癌的高轉移和不良預後密切相關。在具有高轉移潛能的人高轉移大細胞肺癌L9981細胞中存在nm23-HI等位基因雜合性缺失。L9981細胞具有較強的體外克隆和侵襲能力，裸鼠自發性肺轉移能力為100%。已有研究表明，將nm23-HI基因導入L9981細胞系可以逆轉其惡性表型，表現為在裸鼠體內的增殖能力、克隆形成能力、侵襲能力和自發性肺轉移能力顯著降低。清華周等發現nm23-H1基因缺失的肺癌常伴有某些腫瘤侵襲相關分子的異常表達，推測nm23-H1基因可能是“肺癌轉移抑制級聯”相關基因的上遊調控基因，其對腫瘤轉移潛能的抑制作用是通過調控下遊基因實現的。然而，nm23-HI基因逆轉肺癌惡性表型的分子機制尚不清楚。
基因芯片技術為我們研究nm23-H1結構和功能改變導致肺癌侵襲轉移的分子機制提供了理想的技術支持。基因表達譜芯片具有高通量、大規模、高效率、高靈敏度的特點，可以分析兩組或兩組以上不同來源的mRNA豐度的差異。通過計算雜交信號的比率和統計分析，我們可以獲得差異表達的基因信息。
本實驗利用腫瘤基因表達微陣列分析nm23-H1基因轉染L9981細胞前後相關基因的表達變化。基因表達微陣列的應用為研究nm23-H1基因的分子機制提供了基因組學證據，突破了以往單壹基因分離研究的局限。特別是將外源基因導入不表達該基因的細胞，避免了樣品取樣的組織學差異，使得實驗結果更加可靠，也更容易分析。本研究采用含有14 000個基因的SBC-R-HC-100-22cDNA基因表達譜芯片，在L981細胞中轉染nm23-Hl基因。通過比較它們基因表達的差異信息，尋找與nm23-H1基因表達相關的基因。本研究中，* *篩選出1792個差異表達基因。nm23-Hl基因轉染後，共有1156個基因，其中1035個基因。基因表達下調的基因有642個，其中541為未知基因，101為功能原因。已知上調和下調的基因包括:細胞周期和雕亡基因、癌基因、腫瘤抑制基因、轉移相關基因、胞質分裂和轉錄因子、細胞信號和蛋白相關基因、細胞外基質和細胞骨架蛋白。在上調的基因中，有許多與腫瘤轉移相關的基因，如E-Cad、β-catenin、nm23和TIMP-1，2等。，而與腫瘤轉移相關的下調基因主要有Ras、VEGF、PDGF-A、ERK-/、2、c-src等。這些結果與我們之前的研究結果壹致。
但本研究也發現，nm23-H1基因的高表達還可以增加某些腫瘤抑制基因的表達，增強細胞因子和轉錄因子的活性，提高細胞外基質酶的活性，影響細胞骨架蛋白的合成。因此，可以推斷nm23-H1基因可以通過抑制細胞的增殖能力和克隆形成率、降低基質金屬蛋白酶的活性、抑制促血管生成基因的表達等多種途徑抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移，進而抑制腫瘤的侵襲和轉移。可見nm23-Hl基因對L9981細胞惡性表型的逆轉是通過下遊相關基因的調控實現的，是“肺癌轉移抑制級聯”正向調控中的關鍵基因和上遊基因。
總之，腫瘤的侵襲和轉移是多種基因和因素相互作用的結果，壹個或兩個關鍵基因在時間和空間上相互配合，促進了細胞的癌變、侵襲和轉移。因此，在研究腫瘤侵襲轉移的分子機制時，也要分析多個基因，而不僅僅是幾個單壹基因。基因芯片為研究腫瘤的發生發展以及基因之間的相互作用提供了有力的研究工具。本文為原文全文。沒有PDF瀏覽器的用戶應該先下載並安裝原文全文。